1. 实验方法
① 基因敲除（Knockout）
技术：CRISPR/Cas9或同源重组靶向删除特定外显子（如F8 exon 16/17）。
应用：小鼠血友病A/B型。
② 转基因（Transgenic）
技术：显微注射人类突变基因（如R539C、HLAD28/1*1501）至胚胎干细胞或受精卵。
应用：模拟人类错义突变。
③ 敲入（Knock-in）
技术：靶向插入特定突变（如R33Q、G581E）至内源基因位点，保留表达框架。
应用：研究CRM+/-表型。
④ 自然突变模型
技术：筛选自然发生的突变个体（如犬外显子22倒位）。
应用：犬血友病A型（Graham等, 1949；Hough等, 2002）。
2. 实验材料
动物品系：小鼠：C57BL6、BALB/c、C3H等近交系；犬：Chapel Hill、Queen品系。
基因工具：CRISPR/Cas9系统、重组载体、胚胎干细胞（传统方法）。
突变类型：外显子倒位、错义突变（R539C）、提前终止密码子。
3. 造模后验证与检测
3.1 病理检测
① 凝血功能评估：
APTT（活化部分凝血活酶时间）：显著延长（正常值：25-35秒；模型可达>60秒）。
凝血因子活性（FVIII:C/FIX:C）：ELISA或发色底物法检测，重型模型活性<1%。
② 出血表型观察：
尾部出血时间：小鼠>10分钟（正常<2分钟）。
自发性出血：关节肿胀（犬模型）、肌肉血肿（绵羊模型）。
3.2 分子蛋白检测
① 基因型验证：
PCR扩增+Sanger测序：确认外显子敲除或突变位点（如L176P）。
Southern blot：用于大片段缺失或倒位检测（如犬外显子22倒位）。
② 蛋白表达分析：
Western blot：检测FVIII/FIX蛋白缺失（敲除模型）或异常大小（突变模型）。
ELISA：定量血浆凝血因子水平（CRM+模型可能显示正常抗原但无活性）。
③ CRM状态鉴定：
交叉反应抗体：CRM+（蛋白存在但无功能，如R33Q）；CRM-（蛋白完全缺失，如G379E）。
1. 品系选择：C57BL6小鼠免疫耐受性强，适合基因治疗；BALB/c易产生抗体，适合免疫研究。
2. CRM分类：CRM+模型需结合功能实验（如凝血活性检测）明确表型。
3. 自然突变模型：犬外显子22倒位与人类重型血友病A高度相似，是金标准模型。
通过系统选择模型，可针对不同研究目标（机制探索、治疗开发、长期安全性）优化实验设计。
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