1. 非特异性结合怎么办？

① 严格预清洗样本；

② 选择高特异性抗体；

③ 控制抗体用量，在2-5μg/500μl样本为宜。

2. 蛋白互作弱，结果阴性？

① 一定要选择IP级别抗体；

② 诱饵蛋白或互作蛋白表达量过低时会产生蛋白互作弱，结果阴性，可通过WB检测Input样品确认目的蛋白是否存在；内源性互作选择高表达细胞系或组织；

③ 延长孵育时间（12-16小时），使用新鲜样本，避免反复冻融破坏蛋白复合体。

3. 如何确保结果可信？

设置对照：Input（验证蛋白表达）、IgG阴性对照（排除抗体非特异结合）、阳性对照（已知互作蛋白对）

4. 轻重链杂带干扰？

① 尽量使用避开轻重链杂带位置的抗体做WB实验；

② 使用标签抗体磁珠；

③ 使用标记HRP的一抗，直接显色以避开二抗对IP抗体的识别，选用只识别天然构象抗体或仅针对轻链/重链的二抗，减少交叉反应。