问题一：出现大量非特异性荧光（假阳性）

1. 内源性酶干扰

某些高酶活性的组织（如平滑肌），自身的核酸酶会切割DNA。

解决方案：取材后立即固定，且固定要充分，锁死酶活性。

2. 固定液PH值不对

使用了酸性固定液。

解决方案：必须使用PH中性的缓冲福尔马林或4%多聚甲醛。

3. 样品干涸：反应过程中液体流失或蒸发，导致非特异性吸附。

解决方案：严格保湿！可参考“防蒸发小技巧”

防蒸发小技巧：

方法A：使用防蒸发膜。

方法B：裁剪比孔略小的圆形塑料片（或自封袋膜），滴加检测液后覆盖在样品上。这不仅能防止蒸发，还能让液体铺得更均匀。

Tip：裁剪时留个小“把手”，染色结束后方便镊子夹取。

方法C：载玻片可用PAP Pen画圈圈住液体。

问题二：荧光背景过高，甚至细胞质也发光

1. 支原体污染

支原体的DNA也会断裂被标记。

解决方案：实验前务必进行支原体检测。

2. TdT酶浓度过高

反应过强。

解决方案：尝试用稀释液将TdT酶稀释2-5倍后使用。

3. 红细胞干扰

血红蛋白有自发荧光。

解决方案：处理组织样本时，尽量去除红细胞。

问题三：标记效率低，甚至无荧光

1. 固定剂选错

使用了乙醇或甲醇。

解决方案：它们会漏掉小片段DNA，请换回4%多聚甲醛。

2. 固定时间过长

导致交联过度，试剂进不去。

解决方案： 缩短固定时间，或延长通透时间（用蛋白酶K消化时需谨慎控制）。

3. 荧光淬灭

FITC对光敏感，普光照10分钟就可能淬灭。

解决方案：全程避光！避光！避光！

4. 细胞被洗掉了（尤其是贴壁细胞）

凋亡的细胞贴壁能力变弱，一洗就掉。

解决方案：诱导凋亡结束后，先用平底转子离心机 1000g 离心 5分钟，把快飘起来的凋亡细胞“压”回去，再吸除培养基。后续洗涤动作一定要轻柔。

5. 特别注意

如果你使用碘化丙啶（PI）染细胞核，PI颜色过深会淬灭FITC的绿色荧光（能量转移）。

解决方案：降低PI浓度（如0.5μg/ml），或者改用DAPI（蓝色）复染细胞核，蓝绿搭配对比度更好。

为了确保实验结果的可信度，强烈建议在正式实验中设置对照组：

阴性对照：反应液中不加TdT酶，只加dUTP。理论上应无绿色荧光。

目的：排除试剂本身的非特异性结合。

阳性对照：使用DNase I处理正常细胞10-30分钟，人为制造DNA断裂。理论上所有细胞均应呈现强绿色。

目的：验证试剂盒是否有效。