C11-BODIPY 581/591 是铁死亡实验中常用的脂质过氧化探针。
它可定位于细胞膜脂质环境中，发生氧化后荧光发射由红色约590 nm 向绿色约510 nm转变，因此可通过荧光显微镜、流式细胞术或高内涵成像分析脂质ROS变化。
以细胞铁死亡模型为例，建议设置：
Control组：正常培养；
Model组：实验处理组；
Model + Fer-1组：铁死亡抑制剂救援；
Model + Lip-1组：脂质过氧化抑制剂救援，可选；
Positive control组：经典铁死亡诱导体系；
Vehicle组：DMSO溶剂对照。
注意：各组DMSO终浓度保持一致，建议≤0.1%。
C11-BODIPY 581/591；
HBSS或无血清培养基；
PBS；
胰酶或细胞消化液；
Fer-1、Lip-1等抑制剂；
DMSO；
6孔板/12孔板/玻底皿/流式管；
荧光显微镜或流式细胞仪。
C11-BODIPY通常用无水DMSO溶解制备储备液，储备液可参考按1–10 mM范围制备，避光、干燥、-20℃保存。
取对数生长期细胞；
接种于玻底皿或爬片；
处理当天细胞融合度建议控制在60%–80%；
贴壁过夜后进行实验处理。
按分组加入Model处理因素；
Fer-1或Lip-1组建议提前1–2 h预处理；
根据细胞敏感性设置处理时间，一般建议先做6 h、12 h、24 h梯度；
处理结束后进入染色步骤。
从-20℃取出储备液，避光融化；
用预温HBSS或无血清培养基稀释至终浓度1–2 μM；
现配现用，避免反复冻融和长时间暴露在光下。
可参考流程为：细胞用1–2 μM C11-BODIPY孵育30 min，随后用HBSS清洗并进行显微镜或流式检测。
Step 4：染色
弃去原培养基；
PBS轻洗1次；
加入C11-BODIPY工作液；
37℃避光孵育20–30 min；
孵育结束后用HBSS或PBS轻洗2次；
加入适量HBSS或无酚红培养基；
立即拍照。
建议采集两个通道：
氧化型信号：绿色通道，FITC/GFP通道；
还原型信号：红色通道，PE/TRITC附近通道；
结果分析时不建议只看单张荧光图，建议计算绿色/红色荧光比值，或统计绿色信号强度变化。
按分组完成Model处理和抑制剂预处理。
弃培养基；
加入1–2 μM C11-BODIPY工作液；
37℃避光孵育20–30 min；
PBS或HBSS洗涤2次。
贴壁细胞用温和消化液消化；
终止消化后收集细胞；
300–400 g离心5 min；
弃上清，用HBSS重悬；
过40 μm滤网，避免细胞团块；
上机检测。
建议检测：
FITC通道：氧化型C11-BODIPY信号；
PE通道：还原型C11-BODIPY信号；
可加入死活染，排除死细胞干扰。
流式分析可看FITC阳性比例、FITC MFI，或FITC/PE比值。
建议在比较时重点看：
Model组绿色氧化信号是否升高；
Fer-1或Lip-1是否能降低绿色氧化信号；
C11-BODIPY结果是否与MDA、4-HNE、GPX4/SLC7A11/ACSL4等指标一致；
是否排除了普通ROS升高导致的误判；
如果Model组脂质ROS升高，同时Fer-1/Lip-1可部分回调，说明该处理存在铁死亡相关脂质过氧化过程。
可能原因：
探针失效或反复冻融；
染色浓度过低；
孵育时间不足；
处理条件太弱；
显微镜曝光或流式电压设置不合适。
建议：
新鲜配制工作液；
先用1 μM、2 μM、5 μM做小梯度；
加入阳性参考组；
检查显微镜/流式通道设置。
可能原因：
探针浓度过高；
洗涤不充分；
细胞死亡过多；
光照时间过长；
细胞密度过高。
建议：
降低探针浓度；
增加洗涤次数；
缩短拍照曝光时间；
上机前加入死活染排除死亡细胞。
可能原因：
处理强度过高；
死亡方式并非铁死亡为主；
Fer-1浓度或预处理时间不合适；
细胞状态差。
建议：
降低Model处理强度；
增加Lip-1或DFO组；
同步检测凋亡、坏死性凋亡指标；
检查细胞密度、代次和污染情况。
C11-BODIPY必须避光操作；
工作液建议现配现用；
不要只用普通ROS判断铁死亡；
结果建议用绿色/红色比值或流式MFI定量；
细胞死亡过多时，脂质ROS结果容易失真；
必须搭配Fer-1、Lip-1等救援组增强结论可信度。
C11-BODIPY检测的核心不是“拍到绿色荧光”，而是通过脂质过氧化信号升高 + 抑制剂回调 + 其他铁死亡指标一致，建立更可靠的铁死亡证据链。
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