Transwell侵袭实验常用于评价肿瘤细胞等穿过细胞外基质屏障的能力。操作步骤看起来并不复杂，但基质胶铺板、细胞接种量、血清梯度和培养时间中任何一个条件没有控制好，都可能造成孔间差异过大、所有组都穿不过膜，或者膜下细胞多到无法准确计数。

因此，正式实验前最重要的不是直接照搬文献中的“1:8基质胶、1×10⁵个细胞、培养24 h”，而是先通过预实验确定一套适合当前细胞的实验窗口。

图 1丨 Transwell 侵袭实验操作流程示意图

Transwell迁移实验和侵袭实验使用的基本装置相同，主要区别在于膜表面是否增加细胞外基质屏障。

迁移实验通常直接将细胞接种到未包被的Transwell上室，观察细胞穿过微孔膜的能力；

侵袭实验则需要先在膜表面铺一层Matrigel等基质，细胞只有降解并穿过这层基质后才能到达膜下表面。

肿瘤细胞实验中常使用8μm孔径小室。条件允许时，可以同时设置未铺胶的Migration组和铺胶的Invasion组，用于区分单纯迁移能力和穿越基质屏障的能力。

图2丨 Transwell 迁移实验与侵袭实验结构对比

1. 解冻方法与耗材预冷

Matrigel对温度非常敏感，在4 ℃下仍保持流动性，温度超过约10 ℃后会逐渐开始聚合。因此从解冻到稀释、铺板，都应尽量保持低温。

解冻方法：提前一晚将基质胶放在冰上，于2～8 ℃环境缓慢解冻。完全融化后轻轻混匀，再分装成单次使用量，减少反复冻融。

耗材预冷：枪头、EP管、储液槽以及Transwell小室等凡是会接触胶液的耗材，都建议提前预冷。稀释和加样过程中持续将基质胶放在冰上，避免胶液在枪头或管壁中提前聚合。

如果出现明显拉丝、结块或枪头堵塞，说明局部温度可能已经过高，继续强行铺板很容易造成不同孔胶层厚度不一致。

2. 稀释浓度与铺胶量

基质胶通常使用预冷的无血清培养基或相应缓冲液稀释。

Transwell侵袭实验可参考起始范围为100～300 μg/cm²；24孔Transwell膜面积约0.33 cm²，铺胶体积约100 μL。也可使用200～300 μg/mL的Matrigel包被液。正式使用时仍需根据细胞侵袭能力、培养时间和趋化条件优化。

铺胶时缓慢将胶液加入膜面，避免枪头碰触膜，也不要产生气泡。加样完成后确认整个膜面被均匀覆盖，再按要求进行凝胶化。

3. 胶层厚度需要形成合适的实验窗口

基质胶浓度过高或胶层过厚：细胞很难穿过基质，所有组都只有少量穿膜细胞，容易出现假阴性。

浓度过低或胶层过薄：基质屏障作用不足，细胞很容易到达膜下，最终结果与Migration实验差别很小。

合适状态：对照组能够稳定观察到一定数量的穿膜细胞，同时膜下又没有达到大面积重叠或饱和。这里没有适用于所有细胞的统一细胞数标准，应根据当前模型通过预实验确定。

1. 接种前保持细胞状态一致

部分实验会在接种前进行低血清或无血清处理，以降低基础迁移并建立更明显的趋化梯度。但饥饿时间过长也可能造成细胞应激、活率下降甚至死亡，因此不能机械规定所有细胞统一饥饿24 h。

如果需要饥饿处理，首先应通过预实验确认该条件不会明显改变细胞活率。

2. 接种量通过预实验确定

接种细胞过少，穿膜细胞零散，随机误差较大；接种过多，则可能造成膜下细胞重叠，后期无法准确计数。

正式实验前可以设置2～3个细胞密度梯度。理想状态是：对照组有足够数量的穿膜细胞用于统计，同时细胞之间仍能较清楚地区分。

接种前将细胞充分吹匀，避免细胞团进入小室。不同组的细胞数量、悬液体积和接种时间尽量保持一致。

常见设置为：

上室：细胞＋无血清或低血清培养基；

下室：含较高血清浓度的培养基。

下室中的FBS或其他趋化因子提供趋化刺激，部分肿瘤细胞实验会以10% FBS作为起始条件，但实际浓度仍需根据具体细胞调整。

不建议上下室同时加入相同浓度的高血清培养基，因为这样会明显削弱浓度梯度，使实验难以反映趋化驱动下的迁移或侵袭。

加液完成后检查膜下是否存在气泡，气泡会阻断局部膜面与培养液接触，造成同一块板中不同孔结果差异明显。

Transwell孵育时间没有统一标准，从 12 h 到 48 h 都有文献使用，必须匹配细胞侵袭能力。

培养时间过短：对照组穿膜细胞过少，组间差异容易被随机误差放大。

培养时间过长：膜下细胞大量聚集甚至重叠，同时混入明显的细胞增殖效应，结果不再单纯反映侵袭能力。

确定方法：预实验设置多个时间点（如 12 h、24 h、36 h、48 h），选择对照组已经出现稳定穿膜，但尚未接近膜面饱和的时间作为正式实验条件。

先取出小室，用PBS轻轻清洗，再使用湿润棉签从膜上侧轻柔擦除残留细胞和基质。

注意：棉签蘸取少量 PBS 润湿后使用，干棉签摩擦力过大容易戳破膜；擦拭时沿一个方向轻擦，不要反复揉搓。

固定：4% 多聚甲醛固定 15~20 min，PBS 沿孔壁缓慢加入冲洗 2 次；

染色：0.1% 结晶紫染色 10~15 min，随后用清水缓慢冲洗多余染液，水流对着孔壁，不要直接冲膜面；

收尾：将小室晾干，膜面朝下放置在载玻片上，即可镜下观察计数。

图3丨擦膜操作示意图

1. 视野选择与计数规范

数量要求：显微镜下随机选取 5~9 个不重叠的视野（常用 200× 放大倍数），必须避开膜边缘区域—— 边缘效应会导致细胞分布不均，结果偏差极大。

推荐盲法计数：打乱样本编号后再进行计数，避免主观选择视野带来的结果偏差。

2. 能不能只展示 “最好看” 的区域

绝对不能，只挑选阳性细胞最多的视野属于选择性展示数据。

正确做法：随机选视野，展示具有代表性的结果图；统计图纳入所有计数视野的平均值与标准差，如实反映整体水平。

3. 不同批次能否直接比较绝对细胞数

不能。基质胶批次、细胞代次、血清批次、室温差异，都会导致穿膜细胞绝对数出现波动。

正确做法：同一批次内设置对照组与实验组，用相对侵袭率、侵袭抑制率进行组间比较；跨批次仅比较变化趋势，不比较绝对数值。

图4丨结晶紫染色结果图

图5丨不同穿膜细胞密度结果对比图

Transwell侵袭实验最需要通过预实验确定的三个参数是：基质胶包被条件、细胞接种量和培养时间。

在此基础上，再统一细胞状态、血清梯度、擦膜方式、染色条件和计数规则。

参考资料

1. Corning. Cell Invasion Assay Protocol.

2. Corning. Matrigel Matrix Coating of Transwell Inserts.

3. Corning. Top Tips for Handling Corning Matrigel Matrix.

4. Corning. Cell Migration and Invasion Quantification Assay.