双荧光素酶报告基因实验是分子生物学中验证基因表达调控的经典手段，广泛用于启动子/增强子活性分析、转录因子调控和miRNA靶基因验证等场景。

本文从体系设计、共转染操作、数据处理到异常排查，拆解全流程的关键参数与避坑要点。

图1丨双荧光素酶实验流程图

双荧光素酶体系包含两种独立的荧光素酶，可在同一样本中依次完成检测。Promega DLR体系先检测Firefly luciferase，再加入Stop & Glo终止Firefly反应并启动Renilla luciferase反应。

1. 萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）是实验报告基因。 启动子、增强子或3′UTR等待研究序列与Firefly报告基因连接，其发光信号随调控序列活性发生变化。

2. 海肾荧光素酶（Renilla luciferase）通常作为内部参照。 Renilla用于校正转染效率、细胞数量和裂解效率等孔间差异，最终以Firefly/Renilla作为归一化后的报告基因活性。

双报告体系能够减少实验操作造成的数值波动，但Renilla本身也需要保持稳定。共报告质粒加入过多可能影响Firefly表达，因此内参量需要通过预实验确定。

1. 转录因子调控实验同时设置WT和MUT

验证转录因子是否通过特定启动子或增强子位点发挥作用时，建议同时设置野生型报告载体（WT）和关键结合位点突变载体（MUT）。

WT与MUT的主要差异应集中在预测结合位点，载体构建完成后通过Sanger测序确认插入方向和突变序列。结果分析时重点比较转录因子对WT和MUT报告活性的影响是否一致。

2. miRNA靶向实验采用WT/MUT四组设计

验证miRNA与靶基因3′UTR结合时，可将预测结合序列构建到报告载体中，并同步构建结合位点突变载体。

单纯观察到mimic降低WT报告活性并不足以说明具体位点参与调控，还需要结合MUT组变化共同判断。

图 5｜miRNA靶向双荧光素酶实验WT/MUT四组设计示意图

1. 96孔板可从2.5×10⁴ cells/well建立条件

细胞数量需要与所用细胞系和转染试剂匹配。以HEK293细胞配合Lipofectamine LTX为例，96孔板参考条件为2.5×10⁴ cells/well、培养液100 μL/well，转染当天细胞融合度保持在50%～80%；对应总DNA量为100 ng/well，Lipofectamine LTX为0.15～0.35 μL/well。

这一组参数可以作为96孔体系建立时的起始参考。更换细胞系或转染试剂后，细胞数量、DNA量和转染试剂量都需要同步调整，不宜只替换其中一个参数。

2. 同批实验保持相同铺板条件

细胞铺板后应均匀分布，避免明显集中在孔中央或边缘。正式转染时，各组细胞应保持相近的融合度和生长状态，因为细胞密度本身会影响转染效率和报告基因表达。

1. Firefly与Renilla可从10∶1～50∶1开始优化

可通过预实验优化实验报告载体与共报告载体的比例，Firefly∶Renilla为10∶1～50∶1或更高均可作为可行范围。由于Renilla检测灵敏度较高，可以使用较低的内参质粒量，从而减少共转染载体之间的影响。

建立新体系时可以选择10∶1、20∶1和50∶1等梯度进行比较，以Renilla能够稳定检测、同时不明显影响Firefly信号为判断标准。

图6｜不同共报告质粒比例对Firefly报告信号的影响

2. 不同处理组的总DNA量必须配平

加入转录因子表达质粒后，对照组需要使用对应空载体补足，使各组总DNA量保持一致。

以96孔板总DNA 100 ng/well、Firefly∶Renilla设为20∶1为例，可以将Firefly报告载体设为50 ng、Renilla设为2.5 ng，其余47.5 ng用于加入调控质粒及空载体。

若实验组加入25 ng转录因子表达质粒，则再加入22.5 ng空载体；对照组则加入47.5 ng空载体，使两组总DNA均保持100 ng。

同组样本统一配制转染复合物：

同一组中的Firefly报告质粒、Renilla、调控载体和空载体应按确定比例统一配制，再分装到各技术复孔。这样可以减少逐孔配液造成的DNA比例和转染试剂误差。

转染复合物的形成时间也需要统一。以HEK293细胞配合Lipofectamine LTX为例，DNA与转染试剂混合后室温孵育30 min，再加入细胞中，转染18～24 h后可检测报告基因表达。

如果使用Lipofectamine 2000、3000或其他转染体系，则按照对应产品的DNA量、试剂比例和复合时间重新确定条件，不能直接套用LTX参数。

96孔板可使用20 μL Passive Lysis Buffer：

以Promega DLR体系为例，96孔板可在每孔加入20 μL 1× Passive Lysis Buffer进行裂解。Passive Lysis Buffer能够直接裂解贴壁细胞，无需额外刮取或反复冻融。细胞加入裂解液后可室温轻柔振荡约15 min，使样品充分裂解。

同一块板应保持裂解液体积和裂解时间一致。样品混匀以轻柔、充分为主，避免大量气泡影响后续取样。

1Promega DLR体系按固定顺序进行两次读数：

标准检测时，每孔取不超过20 μL细胞裂解液，加入100 μL LAR II后混匀并读取Firefly信号；随后加入100 μL Stop & Glo Reagent，终止Firefly反应并启动Renilla反应，再读取Renilla信号。

发光仪可将预延迟设置为1～2 s，读取时间设置为5～10 s；Promega标准手动程序可设置2 s读数延迟，随后采集10 s发光信号。整块板应保持相同的加样顺序、混匀方式和读取设置。

不同品牌双荧光素酶试剂的底物体积和反应步骤可能不同，因此具体加样体积以对应试剂盒说明书为准，不同体系的检测参数不能直接混用。

图7丨报告基因表达与发光检测流程图

1. 单孔归一化后再计算组内均值

每个技术复孔分别计算Relative Luciferase Activity = Firefly RLU / Renilla RLU，再根据各孔归一化结果计算组内均值并进行统计分析。

不能先分别计算一组样本的Firefly平均值和Renilla平均值，再用两个平均值相除，因为这种处理会丢失每个复孔内部的对应关系。

2. 对照组可进一步归一化为1

需要展示相对变化倍数时，可以将各孔Firefly/Renilla除以对照组Firefly/Renilla均值，使对照组归一化为1，再比较不同处理组的相对变化。

原始Firefly和Renilla数值也应保留并同步检查。Renilla在不同处理组间持续明显变化时，需要重新评估内参载体和转染条件，而不能只依赖最终比值解释结果。

1. Renilla信号稳定比信号强更重要

内参量应控制在能够稳定检测的最低水平。Renilla质粒比例过高可能干扰Firefly表达，因此建立新体系时优先完成内参滴定。

2. 总DNA量和转染试剂比例同步保持一致

不同组只改变研究变量，其余Firefly、Renilla、总DNA、转染试剂和培养条件均应尽量保持一致，否则转染条件本身就会成为额外变量。

3. WT/MUT设计需要真正破坏目标位点

MUT载体应针对关键结合序列进行突变，并完成测序验证。WT和MUT在所有处理下变化完全一致时，应优先重新检查突变设计和载体构建。

4. 两个原始RLU同时异常时先查转染体系

Firefly和Renilla同时明显降低或复孔波动很大时，应先检查细胞状态、铺板密度、转染效率、裂解和读板操作。只有Renilla自身稳定后，Firefly/Renilla归一化才具有可靠的校正意义。

双荧光素酶实验正式开展前，建议先确定细胞铺板数量、总DNA量、Firefly∶Renilla比例和转染试剂用量。实验过程中保持各组总DNA和转染条件一致，检测时统一裂解、加样和读板节奏，结果分析时先完成每个孔的Firefly/Renilla归一化，再进行组间比较。

参考资料

1. Promega. Dual-Luciferase® Reporter Assay System Technical Manual #TM040.

2. Promega. Designing a Bioluminescent Reporter Assay: Normalization.

3. Thermo Fisher Scientific. Transfecting Plasmid DNA into HEK 293 Cells Using Lipofectamine LTX Reagent.